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[行业速递]近红外响应多功能人造皮肤可用于再生伤口愈合
作者：本网站 发布时间：2024-06-12 浏览：
在严重创伤后实现高效伤口修复和皮肤附件再生面临挑战，这主要是因为皮肤移植的稀缺性以及在富含蛋白酶的伤口微环境中药物效果的降低。中国人民解放军总医院付小兵院士/孙晓艳教授&南昌大学王小磊教授设计了一种多功能人造皮肤（NIR-mFAS），具备光热触发的药物释放能力，能够积极全面提高全层伤口的再生潜力。人造皮肤的抗菌壳聚糖/丝素蛋白水凝胶基质通过静电相互作用交联，有效地包裹并持续释放表皮生长因子（EGF），以加速再上皮化和新生血管形成，通过促进修复细胞的迁移和增殖。随后，分散在基质中的光热响应性聚多巴胺纳米粒子（PDA-NPs）在1064纳米近红外光照射下，能够精确控制BMP4的释放，从而通过减少增殖阶段的肌成纤维细胞来抑制瘢痕形成。重要的是，同时控制释放的CHIR99021可以通过诱导肌成纤维细胞转化为类似真皮乳头的细胞，调节细胞命运，促进毛囊和皮脂腺的再生。NIR-mFAS作为先进的药物传递系统，实现了高质量伤口愈合与附件再生，提供了一种智能治疗方法，可以应用于需要协调释放多种药物的其它治疗。该研究以题为“NIR-Responsive Multifunctional Artificial Skin for Regenerative Wound Healing”的论文发表在《Advanced Functional Materials》上。
方案 提供了NIR-mFAS的构建过程及其促进高质量伤口愈合的机制的示意图。它展示了NIR-mFAS是如何通过其光热触发的药物释放能力来指导全层伤口的再生愈合的。具体来说，人造皮肤基质通过静电相互作用交联的壳聚糖和丝素蛋白，有效地封装并持续释放表皮生长因子（EGF），以促进修复细胞的迁移和增殖，加速再上皮化和新生血管形成。同时，分散在基质中的聚多巴胺纳米粒子（PDA-NPs）在1064纳米近红外光照射下，能够精确控制BMP4的释放，减少增殖阶段的肌成纤维细胞，从而抑制瘢痕形成。重要的是，CHIR99021的同步控制释放可以调节细胞命运，诱导肌成纤维细胞转化为类似真皮乳头的细胞，促进毛囊和皮脂腺的再生。因此，NIR-mFAS作为一种先进的药物传递系统，不仅实现了伤口愈合的质量提升，还通过化学药物促进了功能性组织的内源性再生，如血管和附件，无需移植外部组织或细胞。
【NIR-mFAS的表征】
NIR-mFAS中聚多巴胺纳米粒子（PDA-NPs）呈现出球形形状，表面粗糙，直径约为90纳米。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析确认了PDA-NPs的特征官能团。X射线衍射（XRD）分析显示了丝素蛋白（SF）的成功提取，并且观察到SF具有微孔结构和不平整的孔壁，这可能有助于细胞粘附。通过混合壳聚糖（CS）溶液和SF粉末制备的CS-SF水凝胶表现出丰富的网络结构和交错的孔隙。随后，通过向CS-SF水凝胶中加入PDA-NPs溶液制备了CS-SF-PDA水凝胶，并通过添加β-甘油磷酸（β-GP）和胶原蛋白（Col）继续搅拌，成功制备了NIR-mFAS。NIR-mFAS内部孔隙布局更加规则，能够适应组织工程中的细胞。FTIR谱图表明SF蛋白的分子构象在NIR-mFAS中发生了变化，β-折叠结构的比例增加，意味着水凝胶的硬度和长期稳定性提高，为伤口修复提供了可靠的生物相容性水凝胶选择。此外，NIR-mFAS的压缩模量为10.4 ± 0.3 kPa，表明其能够应对一般伤口的压缩行为。最后，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测试了BMP4的载药率，发现随着BMP4浓度的增加，载药率提高，最高可达约60.50% w/w。
【NIR-mFAS的光热性能】
NIR-mFAS在1064纳米近红外光照射下表现出快速的光热响应，温度随照射时间增加而升高，且在不同照射功率下都能迅速升温，最高温度可达40.1°C而不至于造成二次热损伤。光热稳定性实验显示NIR-mFAS在五个照射-冷却周期中表现出良好的光热稳定性。水分保持能力测试表明，NIR-mFAS即使在空气中暴露20分钟后，水分保持率仍高达89.36%，模拟了天然细胞外基质的水分保持能力。溶胀测试显示NIR-mFAS具有良好的亲水性，能迅速膨胀至原始体积的15倍，并在60秒内达到溶胀平衡。剪切变稀行为的测试表明NIR-mFAS可以通过5毫升注射器进行注射，并且在注射到生理盐水中后能保持线性形状。动态频率扫描测试和步进应变测试表明NIR-mFAS具有凝胶特性和自愈合能力。药物释放实验表明，BMP4和EGF的释放率在NIR光照射下显著增加，实现了按需释放，而EGF的释放则表现出持续释放特性，有助于延长其在伤口修复过程中的作用时间。此外，NIR-mFAS还显示出对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的体外抗菌活性。
【具有增强再生能力的 NIR-mFAS Prime 愈合细胞】
通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析了相关基因的表达，发现NIR-mFAS处理可以显著上调HEKs的增殖标志基因Ki67，促进HUVECs中与血管新生、血管舒张和血压调节相关的重要酶eNOS以及血管内皮生长因子VEGF的表达。此外，NIR-mFAS处理还能显著降低HSFs的纤维化表型，通过下调肌成纤维细胞标志基因Col1的表达来抑制瘢痕形成。Wnt信号通路相关的基因LEF1和ALP在NIR-mFAS处理的HSFs中表达水平上升，表明药物诱导效果良好。划痕愈合实验显示，NIR-mFAS显著促进了HEKs和HUVECs的迁移能力，而对HSFs的迁移能力则有显著的抑制作用。管状形成实验表明，NIR-mFAS处理的HUVECs显示出更好的血管形成能力。此外，NIR-mFAS处理的HSFs在形态上发生了从典型的肌成纤维细胞样形状到短圆形颗粒状的转变，并通过ALP染色验证了Wnt/β-catenin信号通路的激活。这些结果表明，NIR-mFAS通过时空控制药物释放，与传统的药物给药方式相比，能更有效地促进伤口修复细胞的增殖、迁移和功能，同时抑制瘢痕形成。
【NIR-mFAS促进伤口快速闭合】
通过在C57BL/6（B6）小鼠上创建全层皮肤伤口，并使用不同的样品进行治疗，观察了伤口的愈合过程。NIR-mFAS在伤口上形成了一层淡黄色的薄膜，部分可见的PDA-NPs被包裹在水凝胶中，这层薄膜覆盖了伤口并持续了至少10天，显示出NIR-mFAS在体内的长期稳定性。通过ImageJ软件评估的伤口闭合率显示，使用NIR-mFAS处理的小鼠伤口闭合速度明显加快，特别是在第10天，NIR-mFAS (+ NIR)组的伤口几乎完全闭合，而其他组的伤口仍未愈合且留有痂皮。此外，通过H&E染色观察到，在第7天时，NIR-mFAS处理的伤口区域观察到含有丰富新血管的肉芽组织。定量分析新形成的表皮在上皮舌的前缘表明，NIR-mFAS (± NIR)治疗不仅导致更快的再上皮化和显著增加的增生性表皮面积，而且还缩短了伤口宽度。这些结果一致表明，NIR-mFAS通过封装和持续释放外源性EGF，显著提高了伤口闭合率，促进了伤口愈合过程，并且与宏观测量和定量分析结果一致，证实了NIR-mFAS在伤口愈合中的应用潜力。
【NIR-mFAS促进早期新生血管形成】
观察了不同治疗组小鼠伤口部位的血管网络，结果显示NIR-mFAS (± NIR)组在伤口愈合的早期阶段（第7天）形成了更密集的血管网络。通过免疫组化染色检测CD31（一种血管内皮细胞标志物）的表达，发现NIR-mFAS (± NIR)组在第7天时CD31的表达显著高于其他组，而到了第14天，CD31的表达水平降低，表明新生毛细血管在伤口愈合过程中发生了退行性变化，这有利于无疤痕愈合。此外，通过双重免疫荧光标记CD31和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）检测成熟血管的数量，发现NIR-mFAS (± NIR)组在第7天时血管数量和成熟血管数量均高于对照组，但在第14天降至最低，这与正常血管新生和退行的动态过程一致。NIR-mFAS通过精确调控药物的持续释放和光热效应下的按需释放，实现了在伤口修复过程中适时促进新生血管形成的能力。这些结果表明，NIR-mFAS通过封装和缓慢释放表皮生长因子（EGF），首先加速血管形成，并通过近红外光触发释放的BMP4和CHIR99021，促进了肌成纤维细胞向类似真皮乳头细胞的转化，从而支持伤口中多种功能性组织的再生。
【NIR-mFAS抑制辐照下疤痕形成】
通过Masson's trichrome染色观察了伤口部位胶原蛋白的分布和排列，结果显示NIR-mFAS (+ NIR)组的小鼠伤口中胶原蛋白排列更加有序、简单，与正常皮肤相似。此外，通过Sirius red染色和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的免疫组化染色评估了胶原蛋白I和III的比例以及肌成纤维细胞的活动，NIR-mFAS (+ NIR)组显示出胶原蛋白I/III比例最低，α-SMA表达水平受到抑制，这表明BMP4的释放抑制了胶原蛋白的过度沉积，有利于无疤痕愈合。此外，还观察到NIR-mFAS (+ NIR)组的小鼠伤口中再生的毛囊和皮脂腺，这是无疤痕愈合的另一个证据。
【NIR-mFAS有助于皮肤附属物的功能再生】
通过H&E染色和免疫荧光染色观察了小鼠伤口中的附件再生情况，结果显示NIR-mFAS (+ NIR)组的小鼠伤口显示出减少的疤痕面积和浓密的新生长毛发，而对照组和NIRH组的小鼠则没有新生长毛发，呈现出光秃的外观。此外，NIR-mFAS (+ NIR)组的小鼠伤口在早期生长期出现了不成熟的皮下毛囊，周围有新形成的皮脂腺，这表明了毛囊和皮脂腺的再生。免疫荧光染色进一步证实了这些结构的存在。这些结果表明，NIR-mFAS在近红外光照射下能够有效促进伤口愈合过程中皮肤附件的再生，与传统治疗方法相比，NIR-mFAS提供了一种促进伤口愈合质量改善的新策略，通过精确控制药物释放，不仅抑制了疤痕形成，还促进了皮肤附件的功能性再生。
【小结】
该研究开发了一种具有开关能力的近红外响应型多功能人造皮肤（NIR-mFAS），它利用生物相容性高且成本效益好的丝素蛋白（SF）和壳聚糖（CS）。通过在全层皮肤伤口模型上评估NIR-mFAS的效果，研究表明，在伤口愈合的早期增殖阶段，NIR-mFAS通过持续释放表皮生长因子（EGF）促进了再上皮化和新生血管形成。在增殖后期，NIR-mFAS响应近红外光的光热效应，释放载药的聚多巴胺纳米粒子（PDA-NPs）中的骨形态发生蛋白4（BMP4）和Wnt激动剂CHIR99021，这导致肌成纤维细胞活性受到抑制，减少瘢痕形成，并促使肌成纤维细胞转化为类似真皮乳头的细胞，以支持伤口中多种功能性组织的再生。此外，NIR-mFAS还展示了在各种情景下，如器官形态发生，通过操控激光辐照和载体实现控制释放的新方法。总体而言，该研究成功突出了NIR-mFAS的开-关释放能力，为将来增强功能性伤口愈合提供了一个有希望的多靶点治疗策略。
【具有增强再生能力的 NIR-mFAS Prime 愈合细胞】
通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析了相关基因的表达，发现NIR-mFAS处理可以显著上调HEKs的增殖标志基因Ki67，促进HUVECs中与血管新生、血管舒张和血压调节相关的重要酶eNOS以及血管内皮生长因子VEGF的表达。此外，NIR-mFAS处理还能显著降低HSFs的纤维化表型，通过下调肌成纤维细胞标志基因Col1的表达来抑制瘢痕形成。Wnt信号通路相关的基因LEF1和ALP在NIR-mFAS处理的HSFs中表达水平上升，表明药物诱导效果良好。划痕愈合实验显示，NIR-mFAS显著促进了HEKs和HUVECs的迁移能力，而对HSFs的迁移能力则有显著的抑制作用。管状形成实验表明，NIR-mFAS处理的HUVECs显示出更好的血管形成能力。此外，NIR-mFAS处理的HSFs在形态上发生了从典型的肌成纤维细胞样形状到短圆形颗粒状的转变，并通过ALP染色验证了Wnt/β-catenin信号通路的激活。这些结果表明，NIR-mFAS通过时空控制药物释放，与传统的药物给药方式相比，能更有效地促进伤口修复细胞的增殖、迁移和功能，同时抑制瘢痕形成。
【NIR-mFAS促进伤口快速闭合】
通过在C57BL/6（B6）小鼠上创建全层皮肤伤口，并使用不同的样品进行治疗，观察了伤口的愈合过程。NIR-mFAS在伤口上形成了一层淡黄色的薄膜，部分可见的PDA-NPs被包裹在水凝胶中，这层薄膜覆盖了伤口并持续了至少10天，显示出NIR-mFAS在体内的长期稳定性。通过ImageJ软件评估的伤口闭合率显示，使用NIR-mFAS处理的小鼠伤口闭合速度明显加快，特别是在第10天，NIR-mFAS (+ NIR)组的伤口几乎完全闭合，而其他组的伤口仍未愈合且留有痂皮。此外，通过H&E染色观察到，在第7天时，NIR-mFAS处理的伤口区域观察到含有丰富新血管的肉芽组织。定量分析新形成的表皮在上皮舌的前缘表明，NIR-mFAS (± NIR)治疗不仅导致更快的再上皮化和显著增加的增生性表皮面积，而且还缩短了伤口宽度。这些结果一致表明，NIR-mFAS通过封装和持续释放外源性EGF，显著提高了伤口闭合率，促进了伤口愈合过程，并且与宏观测量和定量分析结果一致，证实了NIR-mFAS在伤口愈合中的应用潜力。
【NIR-mFAS促进早期新生血管形成】
观察了不同治疗组小鼠伤口部位的血管网络，结果显示NIR-mFAS (± NIR)组在伤口愈合的早期阶段（第7天）形成了更密集的血管网络。通过免疫组化染色检测CD31（一种血管内皮细胞标志物）的表达，发现NIR-mFAS (± NIR)组在第7天时CD31的表达显著高于其他组，而到了第14天，CD31的表达水平降低，表明新生毛细血管在伤口愈合过程中发生了退行性变化，这有利于无疤痕愈合。此外，通过双重免疫荧光标记CD31和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）检测成熟血管的数量，发现NIR-mFAS (± NIR)组在第7天时血管数量和成熟血管数量均高于对照组，但在第14天降至最低，这与正常血管新生和退行的动态过程一致。NIR-mFAS通过精确调控药物的持续释放和光热效应下的按需释放，实现了在伤口修复过程中适时促进新生血管形成的能力。这些结果表明，NIR-mFAS通过封装和缓慢释放表皮生长因子（EGF），首先加速血管形成，并通过近红外光触发释放的BMP4和CHIR99021，促进了肌成纤维细胞向类似真皮乳头细胞的转化，从而支持伤口中多种功能性组织的再生。
通过Masson's trichrome染色观察了伤口部位胶原蛋白的分布和排列，结果显示NIR-mFAS (+ NIR)组的小鼠伤口中胶原蛋白排列更加有序、简单，与正常皮肤相似。此外，通过Sirius red染色和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的免疫组化染色评估了胶原蛋白I和III的比例以及肌成纤维细胞的活动，NIR-mFAS (+ NIR)组显示出胶原蛋白I/III比例最低，α-SMA表达水平受到抑制，这表明BMP4的释放抑制了胶原蛋白的过度沉积，有利于无疤痕愈合。此外，还观察到NIR-mFAS (+ NIR)组的小鼠伤口中再生的毛囊和皮脂腺，这是无疤痕愈合的另一个证据。
【NIR-mFAS有助于皮肤附属物的功能再生】
通过H&E染色和免疫荧光染色观察了小鼠伤口中的附件再生情况，结果显示NIR-mFAS (+ NIR)组的小鼠伤口显示出减少的疤痕面积和浓密的新生长毛发，而对照组和NIRH组的小鼠则没有新生长毛发，呈现出光秃的外观。此外，NIR-mFAS (+ NIR)组的小鼠伤口在早期生长期出现了不成熟的皮下毛囊，周围有新形成的皮脂腺，这表明了毛囊和皮脂腺的再生。免疫荧光染色进一步证实了这些结构的存在。这些结果表明，NIR-mFAS在近红外光照射下能够有效促进伤口愈合过程中皮肤附件的再生，与传统治疗方法相比，NIR-mFAS提供了一种促进伤口愈合质量改善的新策略，通过精确控制药物释放，不仅抑制了疤痕形成，还促进了皮肤附件的功能性再生。
【小结】
该研究开发了一种具有开关能力的近红外响应型多功能人造皮肤（NIR-mFAS），它利用生物相容性高且成本效益好的丝素蛋白（SF）和壳聚糖（CS）。通过在全层皮肤伤口模型上评估NIR-mFAS的效果，研究表明，在伤口愈合的早期增殖阶段，NIR-mFAS通过持续释放表皮生长因子（EGF）促进了再上皮化和新生血管形成。在增殖后期，NIR-mFAS响应近红外光的光热效应，释放载药的聚多巴胺纳米粒子（PDA-NPs）中的骨形态发生蛋白4（BMP4）和Wnt激动剂CHIR99021，这导致肌成纤维细胞活性受到抑制，减少瘢痕形成，并促使肌成纤维细胞转化为类似真皮乳头的细胞，以支持伤口中多种功能性组织的再生。此外，NIR-mFAS还展示了在各种情景下，如器官形态发生，通过操控激光辐照和载体实现控制释放的新方法。总体而言，该研究成功突出了NIR-mFAS的开-关释放能力，为将来增强功能性伤口愈合提供了一个有希望的多靶点治疗策略。
